發(fā)布日期：2017-09-19

現(xiàn)在的基因組編輯工具本身并不能改變基因序列的排布。它們能做的只是在基因組序列上制造幾個(gè)缺口。而真正改變基因組序列，編輯基因組序列的是細(xì)胞本身。

而我們能做的，是最大限度地誘導(dǎo)細(xì)胞按照我們的意愿完成基因組編輯。

那么，到底是怎么個(gè)誘導(dǎo)方式呢？

咱們從基因敲除說起~

如果我們要進(jìn)行基因敲除。

最簡單但也最放任自流的方式是，在我們需要敲除的基因片段上制造一個(gè)切口，讓細(xì)胞自行進(jìn)行修補(bǔ)。這個(gè)過程中，細(xì)胞有可能在缺口上缺失幾個(gè)堿基，插入幾個(gè)堿基。如果缺失或插入的堿基不是3的倍數(shù)，這個(gè)基因就有可能因?yàn)橐拼a突變而出現(xiàn)功能缺失，從而實(shí)現(xiàn)敲除。我們從這些經(jīng)過處理的細(xì)胞中隨機(jī)挑選出一些，分別進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增。這些由單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增形成的細(xì)胞群落被稱作一個(gè)單克隆。用western、PCR等方法分析這些單克隆的基因表達(dá)情況，就可以找到那些目的基因被敲除的細(xì)胞群落，也就是我們需要構(gòu)造的基因敲除單克隆細(xì)胞系。這些單克隆細(xì)胞系的目的基因功能被缺失掉了，但是編碼基因的序列仍然被留在基因組里，只不過被破壞了，無法正常表達(dá)。

另外一個(gè)更可控的方式是我們?cè)谶@個(gè)基因序列距離較遠(yuǎn)的兩個(gè)位點(diǎn)上分別制造一個(gè)切口，兩個(gè)切口間的大片段極有可能因此被刪除。我們可以篩選出這些發(fā)生大片段刪除的單克隆。它們的目的基因幾乎可以從基因組中完全刪除。但是這種方法需要挑更多的單克隆進(jìn)行驗(yàn)證，因?yàn)閮蓚€(gè)位點(diǎn)同時(shí)被切割的概率比單位點(diǎn)被切割的概率更低。

前面講的這兩種方法都需要隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行驗(yàn)證。這個(gè)有點(diǎn)靠運(yùn)氣。

有一個(gè)辦法可以讓我們的單克隆挑選更有目的性，那就是給咱們被編輯細(xì)胞加標(biāo)記。

比如gfp熒光蛋白？抗性基因等等，在它們的兩邊加上目的基因序列的同源臂做成標(biāo)簽序列。把它們放進(jìn)細(xì)胞的同時(shí)，也放進(jìn)去一些基因組編輯工具，在目的序列上制造缺口，增加同源重組的概率，把這些標(biāo)簽給整合進(jìn)去目的基因序列里。而這樣的大片段插入可以同時(shí)破壞目的基因的表達(dá)，造成其功能缺失。這樣我們就可以通過抗性篩選，或者基于熒光表達(dá)的篩選等找到我們的基因敲除細(xì)胞，一舉兩得。

來源：博雅輯因科技（微信號(hào) EdigeneTech）