發(fā)布日期：2017-07-14

去年12月，兩組科學(xué)家發(fā)表了幾種可以阻斷CRISPR-Cas9活性蛋白質(zhì)的重要發(fā)現(xiàn)，而7月12日，研究人員又再次指出，利用其中的一種抗CRISPR蛋白能減少Cas9介導(dǎo)的人類細(xì)胞基因組編輯中的脫靶效應(yīng)。

這一研究成果公布在Science Advances雜志上，由美國加州大學(xué)伯克利分校Jennifer Doudna教授，以及Jacob Corn等人領(lǐng)導(dǎo)完成。

Corn表示，“CRISPRs是細(xì)菌免疫系統(tǒng)的組成部分，對于生物學(xué)來說一個(gè)基本的概念就是如果某種生物開發(fā)出了一種武器，那么它也會同時(shí)準(zhǔn)備好一種防御手段。事實(shí)證明。 。 。噬菌體已經(jīng)進(jìn)化出了關(guān)閉CRISPR系統(tǒng)的方式，就是這些抗CRISPR蛋白。”

去年年底，Corn與加州大學(xué)舊金山分校的Joseph Bondy-Demony等人共同發(fā)現(xiàn)了幾種存在于李斯特菌中的抗CRISPR蛋白，其中兩種蛋白抑制劑AcrIIA2和AcrIIA4阻斷來自釀膿鏈球菌的Cas9酶活性，Cas9是一種經(jīng)常用于基因組編輯中的DNA切割酶。

在此基礎(chǔ)上，為了深入探索AcrIIA4的作用機(jī)制，研究人員采用了多種方法，如冷凍電子顯微鏡和人體細(xì)胞培養(yǎng)等方法，發(fā)現(xiàn)這種抗CRISPR蛋白是通過競爭綁定到通常是用來結(jié)合DNA的Cas9酶上“凹陷袋”結(jié)構(gòu)域來發(fā)揮作用的，這樣能阻斷Cas9酶與DNA的相互作用。

這次首次針對天然蛋白抑制劑AcrIIA4如何與Cas9酶相互作用的研究，研究人員發(fā)現(xiàn)AcrIIA4會與“凹陷袋”內(nèi)的酶結(jié)合，AcrIIA4與酶的結(jié)合可阻止Cas9酶附著于靶標(biāo)DNA并對其進(jìn)行切割。對人類細(xì)胞的研究揭示，如果這些細(xì)胞在基因編輯開始前就用這一蛋白抑制劑進(jìn)行處理，那么CRIPSR-Cas復(fù)合物就可大體上被阻止對任何部位的DNA進(jìn)行剪切。

結(jié)果還顯示，大約一半的CRISPR-Cas9對DNA的擊中目標(biāo)的編輯（即該系統(tǒng)按照科學(xué)家所希望的方式對基因編輯進(jìn)行正確的剪切）發(fā)生在這一系統(tǒng)進(jìn)入后的6小時(shí)內(nèi)。之前的研究顯示CRISPR-Cas9可能在偏離靶標(biāo)部位留置一段時(shí)間，但未對它們進(jìn)行剪切。通過利用這一時(shí)間差，研究人員在人類白血病細(xì)胞內(nèi)引進(jìn)了一個(gè)被指示對2個(gè)基因（其中包括與鐮狀細(xì)胞病有關(guān)的基因）進(jìn)行剪切的CRISPR-Cas9復(fù)合物，并接著在6小時(shí)后添加了AcrIIA4。結(jié)果顯示，在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間添加AcrIIA4可防止在錯(cuò)誤的位置剪切基因，同時(shí)CRISPR也仍有時(shí)間在正確的位置進(jìn)行基因剪切。

這項(xiàng)研究指出了AcrIIA4的作用機(jī)制，提示了一種新的調(diào)控哺乳動物細(xì)胞基因編輯的方法。最重要的是在引入CRISPR-Cas9數(shù)小時(shí)后將AcrIIA4添加到人類白血病細(xì)胞中，在不影響CRISPR正確剪切的同時(shí)，可減少CRISPR-Cas9的脫靶效應(yīng)，

“雖然這一研究工作和發(fā)現(xiàn)令人印象深刻，而且十分重要，但并不是十分出乎我們的意料。因?yàn)檫@對于抗CRISPR蛋白作用來說非常合乎邏輯。這種機(jī)制。。。以前在其他系統(tǒng)中就曾經(jīng)有過，之前的研究也發(fā)現(xiàn)過通過噬菌體核酸酶抑制劑蛋白的DNA模擬。”麻省大學(xué)Erik Sontheimer教授說，Sontheimer教授雖然沒有參與這項(xiàng)研究，但他是Intellia Therapeutics的共同創(chuàng)始人（另外一位創(chuàng)始人就是Jennifer Doudna），目前這一公司正在利用天然蛋白抑制劑（并非AcrIIA4）進(jìn)行研發(fā)。

來自多倫多大學(xué)的分子遺傳學(xué)家Alan Davidson（未參與這項(xiàng)工作）表示，近期Nature雜志，Molecular Cell雜志都發(fā)表了類似的成果，Davidson與Sontheime等人一起申請了另外三種抗CRISPR化合物的專利。“這些都有基本相同的結(jié)構(gòu)，相同的蛋白，以及類似的結(jié)論。我認(rèn)為這篇最新論文唯一的差異就是一些關(guān)于基因組編輯的數(shù)據(jù)，即基因編輯時(shí)抗CRISPR能減少少脫靶效應(yīng)。”

這是一個(gè)非常有競爭力的領(lǐng)域，從各方面的論文來看，這一領(lǐng)域發(fā)展的非常快。

Corn表示，這些抗CRISPR蛋白不僅可以用于遺傳學(xué)研究，而且也可以作為臨床工具。它們不僅有助于減少脫靶效應(yīng)，還可以成為控制打靶的有效途徑，比如一些基因治療方法也許會在患者細(xì)胞內(nèi)殘留下活性Cas9，這需要被關(guān)閉，“基因編輯的開關(guān)非常關(guān)鍵，但關(guān)閉開關(guān)也是同樣重要的。”

不過目前還需要進(jìn)行更多效應(yīng)和安全性研究，科學(xué)家們需要了解這些抗CRISPR蛋白的人類免疫反應(yīng)是什么，因?yàn)樗鼈儊碜约?xì)菌病毒。“我們只是進(jìn)行單純的抗CRISPR蛋白研究，沒有人知道是否還有其它的工具在等著我們。”

參考資料

Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic

來源：生物通